小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)原代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn) 

實(shí)驗(yàn)步驟
一、取得小鼠胚胎

1.  性成熟母小鼠與種公鼠按1公（♂）:2母（♀）比例合籠。

2.  每天早上觀察母小鼠口。有乳白色或蛋黃色凍膠狀物(栓)即確定為懷孕。見栓當(dāng)天上午定為懷孕的0.5d。

3.  取懷孕12.5～14.5 d母鼠，斷頸處死，無菌條件下暴露子宮。

4.  用鑷子提起近子宮頸端，分離子宮系膜，剪斷子宮角。


5.  取出整個(gè)子宮，置于有PBS的平皿內(nèi)。用PBS洗滌三次，棄除表面殘余血跡。

6.  沿子宮系膜側(cè)剪開子宮，取出帶有胎膜的胚胎，置于另一盛有PBS的平皿內(nèi)，充分洗滌，棄除表面紅細(xì)胞。

7. 用小鑷子撕破胎膜，取出胎鼠，棄除胎膜，用PBS洗滌三次。

8. 去除胚胎頭部、內(nèi)臟和四肢，將軀干部置于另一盛有PBS的平皿內(nèi)，用PBS至少洗滌三次，充分棄除紅細(xì)胞。

二、取得小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF）

1.  用無菌眼科小剪刀或刮胡刀片將鼠胚軀干剪(切)成1mm3以下的碎塊，吸置于離心管內(nèi)。

2.  加適量*，將離心管置于培養(yǎng)箱中10-20分鐘

3.  取出離心管，反復(fù)吹打，加足量培養(yǎng)液終止消化。

4.  離心1000轉(zhuǎn)，5分鐘。

5.  棄掉上清，加適量培養(yǎng)液，反復(fù)吹打20次。

6. 分裝到T75中，一般每2個(gè)胚胎可以制成一個(gè)T75的原代細(xì)胞。

7. 置37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

8.  待細(xì)胞長3-7天細(xì)胞互相重疊爬滿整個(gè)培養(yǎng)瓶底時(shí)即可1：3-1：6傳代。

9.  吸棄培養(yǎng)液上清。

10. PBS（不含鈣鎂）沖洗兩次。

11.  加0.25%*-0.02EDT消化。

12.  在顯微鏡下觀察，當(dāng)少量細(xì)胞漂浮，貼壁的細(xì)胞層出現(xiàn)裂隙時(shí)，用移液管吹打沖洗瓶底5-6次。

13.  即刻加MEF培養(yǎng)液終止消化。

14. 1000轉(zhuǎn)，5分鐘離心。吸棄上清。

15.  加足培養(yǎng)液，吹打制成單細(xì)胞懸液，分裝到各T75中。完成傳代。

16.  原代細(xì)胞中還有少量組織塊未被充分消化，在以后的每次傳代過程中要盡量制成單細(xì)胞懸液，組織塊會(huì)逐漸消失。

17.  原代細(xì)胞中混有一些雜細(xì)胞，一般傳到第3代時(shí)，雜細(xì)胞逐漸減少。小鼠胚胎成纖維細(xì)胞為梭狀；但連成片時(shí)，細(xì)胞互相交聯(lián)，形態(tài)不典型。

三、MEF的凍存

1.  當(dāng)細(xì)胞 90%-100% 融合時(shí)，尤其細(xì)胞少量堆聚可冷凍。

2.  處理方法同二的9-14，每75 cm2 的細(xì)胞 加3 ml 凍存液重懸細(xì)胞。

3. 每個(gè)凍存管編號(hào)加1 ml細(xì)胞懸液。

4. 置入程序降溫盒-80℃過夜，放入液氮長期保存。

四、滅活MEF制備飼養(yǎng)層細(xì)胞

1.  取新的培養(yǎng)瓶，加0.1% Gelatin溶液覆蓋預(yù)處理30分鐘，用前吸掉Gelatin溶液。

2.  取需要處理的MEF細(xì)胞，以10ug/ml濃度加（Mitomycin C）混勻。

3.  置培養(yǎng)箱中3小時(shí)。

4.  吸棄廢液。

5.  用DPBS洗5遍。

6.  處理方法同二11-14。

7.  處理過的MEF加適量培養(yǎng)液重懸計(jì)數(shù)，以3.0×104/ cm2（MEF）鋪在Gelatin處理過的培養(yǎng)瓶上。

8.  置培養(yǎng)箱中靜置過夜，使其貼壁。

9.  鋪好的飼養(yǎng)層在1-7天內(nèi)有效，都可以支持mES生長并維持其性