PCR操作范例及反應(yīng)體系的組成

一、 PCR 操作范例 在一個(gè)典型的 PCR 反應(yīng)體系中需加入：適宜的緩沖液、微量的模板 DNA 、 4 × dNTPs 、耐熱性多聚酶、 Mg 2 和兩個(gè)合成的 DNA 引物。模板 DNa 94 ℃變性 1min ，引物與模板 40 ～ 60 ℃退火 1min ， 72 ℃延伸 2min 。在循環(huán)前模板預(yù)變性 3 ～ 5min ；在末次循環(huán)后，樣品仍需繼續(xù)延伸 3 ～ 5min 以上，確保擴(kuò)增的 DNA 為雙鏈 DNA 。為便于了解 PCR 反應(yīng)中各成份的組成，加入量和反應(yīng)條件，使人們以此為基礎(chǔ)，對(duì)不同的研究對(duì)象逐項(xiàng)改變來找到反應(yīng)條件，特列舉 Perkin Elmer Cetus 公司 Gene Amp DNA 試劑盒提供的典型反應(yīng)條件供參考。  
表 22-1 PCR 反應(yīng)混合液  
 

的總濃度為 0.8mmol/L ，低于 1.5mmol/L 的 Mg 2 濃度。因此，在高濃度 DNA 及 dNTP 條件時(shí)，必須相應(yīng)調(diào)整 Mg 2 的濃度。 2 ． Tris -HCl 緩沖液在 PCR 中使用 10 ～ 50mmol/L 的 Tris – HCl 緩沖液，很少使用其他類型的緩沖液。 Tris 緩沖液是一種雙極化的離子緩沖液， pKa 為 8.3(20 ℃ ), △ pKa 為 0.021/ ℃。因此， 20mmol/l Tris pH8.3(20 ℃ ) 時(shí)，在典型的熱循環(huán)條件下，真正的 pH 值在 7.8 ～ 6.8 之間。  
3 ． KCl 濃度 K 濃度在 50mmol/L 時(shí)能促進(jìn)引物退火。但現(xiàn)在的研究表明， NaCl 濃度在 50mmol/L 時(shí)， KCl 濃度高于 50mmol/L 將會(huì)抑制 Taq 酶的活性，少加或不加 KCl 對(duì) PCR 結(jié)果沒有太大影響。  
4 ．明膠明膠和 BSA 或非離子型去垢劑具有穩(wěn)定酶的作用。一般用量為 100 μ g/ml ，但現(xiàn)在的研究表明，加或不加都能得到良好和 PCR 結(jié)果，影響不大。  
5 ．二甲基亞砜（ DMSO ）　　在使用 Klenow 片段進(jìn)行 PCR 時(shí) DMSO 是有用的；加入 10%DM － SO 有利于減少 DNA 的二級(jí)結(jié)構(gòu)，使（ G C ） % 含量高的模板易于*變性，在反應(yīng)體系中加入 DMSO 使 PCR 產(chǎn)物直接測(cè)序更易進(jìn)行，但超過 10% 時(shí)會(huì)抑制 Taq DNA 聚合酶的活性，因此，大多數(shù)并不使用 DMSO 。  
 
二、四種脫氧三磷酸核苷酸（ 4 × dNTPs ）  
在 PCR 反體系中 dNTP 終濃度高于 50mmol/L 會(huì)抑制 Taq 酶的活性，使用低濃度 dNTP 可以減少在非靶位置啟動(dòng)和延伸時(shí)核苷酸錯(cuò)誤摻入，高濃度 dNTPs 易產(chǎn)生錯(cuò)誤摻入，而濃度太低，勢(shì)必降低反應(yīng)物的產(chǎn)量。 PCR 常用的濃度為 50 ～ 200 μ mol/L ，不能低于 10 ～ 15 μ mol/L 。四種 dNTP 的濃度應(yīng)相同，其中任何一種濃度偏高或偏低，都會(huì)誘導(dǎo)聚合酶的錯(cuò)誤摻入，降低合成速度，過早終止反應(yīng)。  
決定zui低 dNTP 濃度的因素是靶序列 DNA 的長(zhǎng)度和組成，例如，在 100 μ l 反應(yīng)體系中， 4 × dNTPs 濃度若用 20 μ mol/L ，基本滿足合成 2.6 μ g DNA 或 10pmol 的 400bp 序列。 50 μ mol/L 的 4 × dNTPs 可以合成 6.6 μ g DNA, 而 200 μ mol/L 足以合成 25 μ g/DNA 。  
購自廠商的 dNTP 溶液一般均未調(diào) pH ，應(yīng)用 1mol/l NaOH 將 dNTP 貯存液 pH 調(diào)至 7.0 ，以保證反應(yīng)的 pH 值不低于 7.1 。市購的游離核苷酸凍 干粉，溶解后要用 NaOH 中和，再用紫外分光光度計(jì)定量。  
 
三、引物的量  
引物在 PCR 反應(yīng)中的濃度一般在 0.1 ～ 1 μ mol/L 之間。濃度過高易形成引物二聚體且產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物。一般來說用低濃度引物經(jīng)濟(jì)、特異，但濃度過低，不足以完成! 
 
DNA 形成結(jié)合物，在紫外燈下能發(fā)射熒光，使 EB 的熒光強(qiáng)度增強(qiáng) 80 ～ 100 倍，所以，電泳后凝膠在紫外燈下可直接觀察。一般肉眼觀察 DNA 量可達(dá) 10ng ，其熒光強(qiáng)度與 DNA 含量成正比。 
  
30 個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)，則會(huì)降低 PCR 的產(chǎn)率。  
 
四、Taq DNA 聚合酶的量  
　　典型 PCR 反應(yīng)混合物中，所用酶濃度為 2.5U/ μ l ，常用范圍為 1 ～ 4U/100 μ l 。由于 DNA 模板的不同和引物不同，以及其它條件的差異，多聚酶的用量亦有差異，酶量過多會(huì)導(dǎo)致非特異產(chǎn)物的增加。  
　　由于生產(chǎn)廠家所用兵配方、制造條件以及活性定義不同，不同廠商供應(yīng)的 Taq DNA 聚合酶性能也有所不同。  
Cetus 公司酶定義是： 1 個(gè)酶單位是指在以下分析條件下，于 74 ℃， 30min 內(nèi)使 10nmmol 的 dNTP 摻入酸不溶性成分所需的酶。測(cè)定時(shí)間為 10min ，折算成 30min 摻入量。  
　　分析條件為 25nmol/L TAPS （三羥基 - 甲基 - 氨基丙烷磺酸鈉 pH9.3,25 ℃） ,50mmol/l KCl, 2mmol/L MgCl 2 ,1mmol/L β -ME （巰基乙醇）， dATP 、 dTTP 、 dGTP 各 200mmol/L ， dCTP 為 100mmol/L( 由不標(biāo)記及α - 32 P 標(biāo)記混合 ) ， 12. μ g 變性鯡魚 DNA ，zui終體積 50 μ l 。  
 
五、模板  
　　單、雙鏈 DNA 或 RNA 都可以作為 PCR 的樣品。若起始材料是 RNA ，須先通過逆轉(zhuǎn)錄得到*條 cDNA 。雖然 PCR 可以僅用極微量的樣品，甚至是來自單一細(xì)胞的 DNA ，但為了保證反應(yīng)的特異性，還應(yīng)用 ng 級(jí)的克隆 DNA ，μ g 水平的單拷貝染色體 DNA 或 10 4 拷貝的待擴(kuò)增片段作為起始材料，模板可以是粗品，但不能混有任何蛋白酶、核酸酶、 Taq DNA 聚合酶抑制劑以及能結(jié)合 DNA 的蛋白。  
DNA 的大小并不是關(guān)鍵的因素，但當(dāng)使用*分子量的 DNA （如基因組的 DNA 時(shí)），如用超聲處理或用切點(diǎn)罕見的限制酶（如 Sal 1 和 Not 1 ）先行消化，則擴(kuò)增效果更好。閉環(huán)靶序列 DNA 的擴(kuò)增效率略低于線狀 DNA ，因此，用質(zhì)粒作反應(yīng)模板時(shí)先將其線狀化。  
　　模板靶序列的濃度因情況而異，往往非實(shí)驗(yàn)人員所控制，實(shí)驗(yàn)可按已知靶序列量逆減的方式（ 1ng,0.1ng,0.001ng 等），設(shè)置一組對(duì)照反應(yīng)，以檢測(cè)擴(kuò)增反應(yīng)的靈敏度是否符合要求。  
 
六、石蠟油  
PCR 擴(kuò)增時(shí)建議在混合物上面鋪一層石蠟油，減少 PCR 過程中尤其是變性時(shí)液體蒸發(fā)所造成的產(chǎn)物的丟失。研究表明，應(yīng)用石蠟油可使擴(kuò)增產(chǎn)量增加 5 倍，可能與石蠟油維持熱恒定和整個(gè)反應(yīng)體系中鹽濃度有關(guān)。  
 
 
 
電泳分析  
　　在實(shí)際工作中常采用瓊脂糖凝膠電泳。一般情況下先在電泳緩沖液或凝膠中加 1% 溴化乙錠（ EB ）（每 100ml 加 100 μ l ），然后將已經(jīng)制備好的 1% ～ 2% 瓊脂糖凝膠（用電泳緩沖液配制）放入電泳槽內(nèi)，加入待測(cè)樣品 10 μ l ，同時(shí)用分子量標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)記。瓊脂糖濃度應(yīng)按分離 DNA 片段的大小進(jìn)行選擇，一般用 1.5% ～ 2% ，電泳電壓 75V ，待樣品進(jìn)行凝膠內(nèi)距膠末端 1cm 時(shí)，切斷電源，取出凝膠在紫外燈下直接觀察結(jié)果。  
　　由于溴化乙錠可與雙鏈  
 
DNA 形成結(jié)合物，在紫外燈下能發(fā)射熒光，使 EB 的熒光強(qiáng)度增強(qiáng) 80 ～ 100 倍，所以，電泳后凝膠在紫外燈下可直接觀察。一般肉眼觀察 DNA 量可達(dá) 10ng ，其熒光強(qiáng)度與 DNA 含量成正比。  
DNA 分子在凝膠中泳動(dòng)速度決定于電荷效應(yīng)及分子效應(yīng)。前者由所帶凈電荷量決定，而后者與分子大小及構(gòu)型有關(guān)。按照 DNA 分子大小，其凝膠濃度可做不同的調(diào)整。有條件的實(shí)驗(yàn)室也可用聚丙烯酰胺凝膠電泳（ PAGE ）分析擴(kuò)增的 DNA 片段。  

表 22-2 電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果， EB 熒光顯色（ 254nm ）