小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)原代培養(yǎng)實驗 *消化法2

一、實驗材料準(zhǔn)備

1.   動物

孕期14至16天的孕鼠(小鼠)。

2.   試劑
無Ca2+和Mg2+的PBS(D-PBS)、0.05%*、0.53 mmol/L EDTA溶液、MEF生長培養(yǎng)基(高糖DMEM加10%FBS)。

3.  器械

眼科直剪3把、眼科直鑷3把、眼科彎鑷2把、玻璃平皿3套、200目尼龍濾網(wǎng)、50 ml和15 ml離心管和*片。以上物品均需要高壓滅菌消毒處理。

二、具體操作

1.  處死孕鼠，全身置于75%酒精里浸泡，然后在超凈臺中用剪刀和鑷子將孕鼠皮膚剪開，用另外一組剪刀、鑷子剪開腹部肌層，露出子宮，zui后用第三組剪刀和鑷子將子宮小心取出放在盛有D-PBS的玻璃平皿中，沖洗去血。

2.  用兩把彎鑷子將胚胎外的胞膜小心去除，然后夾掉頭和內(nèi)臟，將其余胚胎轉(zhuǎn)移到一個裝有30 ml D-PBS的50 ml離心管中，輕輕顛倒兩次，倒掉D-PBS，再重復(fù)此步驟一次，注意要留少許D-PBS，然后將胚胎轉(zhuǎn)移到另一裝有D-PBS的平皿中，并用*片將其細細切碎。

3.  用200 μl的移液槍反復(fù)、快速地吹打平皿中的液體，轉(zhuǎn)移至15 ml離心管中，于4℃ 1500 rpm離心5分鐘，倒掉上清，以10 ml*重懸沉淀，放在37℃水浴中消化30分鐘，且每隔五分鐘輕輕晃動，使之充分消化。

4.   將上層細胞懸液倒入一個裝有10 ml MEF生長培養(yǎng)基的50 ml離心管中，用200目的尼龍網(wǎng)過濾后，以1 500 rpm離心5分鐘收集細胞，再用30 ml MEF生長培養(yǎng)基洗滌兩次。

5.  細胞沉淀用15 ml MEF生長培養(yǎng)基重懸后進行細胞計數(shù)(一般8只14天的胎鼠可獲得2-3×107細胞)。

6.   3×106細胞懸浮于15 ml MEF生長培養(yǎng)基中，接種到200 ml培養(yǎng)瓶中。

7.  24小時后更換新鮮的MEF生長培養(yǎng)基。

8.  細胞長滿后，先用D-PBS沖洗，倒掉后加*消化(此步時間不宜過長，作者一般不超過五分鐘)，按1:5傳代。

9.  細胞再次長到覆蓋率80-90%左右，將其消化后，常規(guī)凍存(凍存液要現(xiàn)配)。


小鼠胚胎成纖維細胞(MEF 100倍)

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收起
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注意事項
1.   原代培養(yǎng)，一定要避免污染。

2.   MEF生存能力有限，如果不凍存，體外存活十代左右。

3.  凍存后復(fù)蘇的細胞只能傳代一次，因為這些細胞繁殖能力有限。

4.  消化細胞時間不要過長。