熒光定量PCR技術(shù)及其應(yīng)用

熒光定量PCR（也稱TaqMan PCR,以下簡(jiǎn)稱FQ-PCR）是美國PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)，該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針來實(shí)現(xiàn)其定量功能的，與變通PCR相比，F(xiàn)Q- PCR具有許多優(yōu)點(diǎn)。本文擬就該技術(shù)的特點(diǎn)、原理和方法以及應(yīng)用作一簡(jiǎn)要敘述。 
1 特點(diǎn) 
FQ-PCR不僅具有普通PCR的高靈敏性，而且由于熒光探針的應(yīng)用，可以通過光電傳導(dǎo)系統(tǒng)直接探測(cè)PCR擴(kuò)增過程中熒光信號(hào)的變化以獲得定量結(jié)果，所以還具有DNA雜交的高特異性和光譜技術(shù)的高性，克服了常規(guī)PCR的許多缺點(diǎn)。如一般PCR產(chǎn)物都需通過瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色紫外光觀察結(jié)果或通過聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染檢測(cè)，不僅需要多種儀器，而且費(fèi)時(shí)費(fèi)力，所使用的染色劑溴化乙錠對(duì)人體又有害，這些繁雜的實(shí)驗(yàn)過程又給污染和假陽性提供了機(jī)會(huì)。而FQ-PCR只須在加樣時(shí)打開一次蓋子，其后的過程*是閉管操作，不需要PCR后處理，避免了常規(guī)PCR操作中的諸多弊端。實(shí)驗(yàn)一般使用PE公司研制的ABI7100型PCR擴(kuò)增儀。該儀器具有以下特點(diǎn)：①應(yīng)用廣泛：可用于DNA和RNA的PCR產(chǎn)物定量、基因表達(dá)研究、病原體檢測(cè)及PCR條件的優(yōu)化等。②*的定量原理：采用熒光標(biāo)記探針，經(jīng)激光激發(fā)后熒光量隨PCR循環(huán)而累積，從而達(dá)到定量目的。③工作效率高：內(nèi)置9600型PCR擴(kuò)增儀，電腦控制1～2小時(shí)全自動(dòng)同步完成96個(gè)樣品的擴(kuò)增及定量。④無須凝膠電泳：無須對(duì)樣品進(jìn)行稀釋和電泳，只須通過特殊探頭在反應(yīng)管內(nèi)直接檢測(cè)。⑤無管道內(nèi)污染：采用*全封閉反應(yīng)管及光電傳導(dǎo)系統(tǒng)，無須顧及污染。⑥結(jié)果重現(xiàn)性好：定量動(dòng)態(tài)范圍高達(dá)五個(gè)數(shù)量級(jí)。所以自從此項(xiàng)技術(shù)研制成功以來，受到許多科研工作者的重視并在多個(gè)領(lǐng)域得到應(yīng)用。 
 
2 原理和方法 
FQ- PCR的工作原理[1～4]是利用Taq酶的5’→3’外切酶活性，在PCR反應(yīng)系統(tǒng)中加入一個(gè)熒光標(biāo)記探針。該探針可與引物包含序列內(nèi)的DNA模板發(fā)生特異性雜交，探針的5’端標(biāo)以熒光發(fā)射基因FAM（6-羧基熒光素，熒光發(fā)射峰值在518nm處），靠近3’端標(biāo)以熒光淬滅基團(tuán)TAMRA（6-羧基四甲基若丹明，熒光發(fā)射峰值在582nm處），探針的3’開端被磷酸化以防止探針在PCR擴(kuò)增過程中被延伸。當(dāng)探針保持完整時(shí)，淬滅基團(tuán)抑制發(fā)射基團(tuán)的熒光發(fā)射。發(fā)射基團(tuán)一旦與淬滅基團(tuán)發(fā)生分離，抑制作用被解除，518nm處的光密度增加而被熒光探測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)到。復(fù)性期探針與模板DNA發(fā)生雜交，延伸期Taq 酶隨引物延伸沿DNA模板移動(dòng)，當(dāng)移動(dòng)到探針切斷，淬滅作用被解除，熒光信號(hào)釋放出來（見圖）。模板每復(fù)制一次，就有一個(gè)探針被切斷，伴隨一個(gè)熒光信號(hào)的釋放。由于被釋放的熒光基團(tuán)數(shù)目和PCR產(chǎn)物數(shù)量是一對(duì)一的關(guān)系，因此用該技術(shù)可對(duì)模板進(jìn)行準(zhǔn)確定量。實(shí)驗(yàn)儀器一般使用PE公司研制的ABI7100型 PCR擴(kuò)增儀，也可用其它PCR儀。如果用ABI7700型反應(yīng)型反應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)結(jié)束后，通過電腦分析，可直接給出定量結(jié)果。如果用其他PCR 儀，則需要同時(shí)使用熒光探測(cè)儀測(cè)量反應(yīng)管中的熒光信號(hào)，計(jì)算出RQ+、RQ-、△RQ。RQ+代表樣品管熒光發(fā)射基團(tuán)發(fā)光強(qiáng)度與淬滅基團(tuán)發(fā)光強(qiáng)度的比率，RQ-代表空白管中二者的比率，△RQ（△RQ=RQ+-RQ-）代表PCR過程中熒光信號(hào)變化量，經(jīng)過數(shù)據(jù)處理，即可得出定量結(jié)果。由于熒光探針的引入，顯著提高了實(shí)驗(yàn)的特異性。探針設(shè)計(jì)一般應(yīng)符合以下條件[2]：①探針長(zhǎng)度應(yīng)在20～40個(gè)堿基左右，以保證結(jié)合的特異性。②GC堿基含量在 40%～60%，避免單核苷酸序列的重復(fù)。③避免與引物發(fā)生雜交或重疊。④探針與模板結(jié)合的穩(wěn)定程度要大于引物與模板結(jié)合的穩(wěn)定程度，因此探針的Tm值要比引物的 
Tm值至少高出5℃。另外，探針的濃度、探針與模板序列的同源性，探針與引物的距離都對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有影響。 
 
圖.TaqMan PCR反應(yīng)模式 （A）聚合反應(yīng)；（B）鏈置換；（C）裂解； （D）聚合完成（R：FAM；Q：TAMRA，F(xiàn)P：上游引物；RP：下游引物）
圖.TaqMan PCR反應(yīng)模式 （A）聚合反應(yīng)；（B）鏈置換；（C）裂解； （D）聚合完成（R：FAM；Q：TAMRA，F(xiàn)P：上游引物；RP：下游引物）
 
3 應(yīng)用 
由于FQ-PCR具有高靈敏性，高特異性和高性的特點(diǎn)，目前，該項(xiàng)技術(shù)已被應(yīng)用于病原體測(cè)定、腫瘤基因檢測(cè)、免疫分析、基因表達(dá)、突變及其多態(tài)性的研究等多個(gè)領(lǐng)域。 
 
3.1 病原體測(cè)定 
由于PCR技術(shù)的問世，使得病原體檢測(cè)能夠快速而方便的進(jìn)行。但由于其高靈敏性，實(shí)驗(yàn)操作很容易受到污染而出現(xiàn)假陽性。只要有微量病原體存在，PCR擴(kuò)增即可為陽性結(jié)果，但并不能作為診斷依據(jù)，只有當(dāng)一定數(shù)量的病原體存在時(shí)才有臨床意義，因此結(jié)模板定量顯得特別重要。常規(guī)PCR由于不能定量而限制了其應(yīng)用，然而，PE公司研制的FQ-PCR技術(shù)給解決這一問題提供了可能。目前該技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于丙肝病毒、人類瘤病毒、結(jié)核桿菌和食品中大腸桿菌等許多病原體的檢測(cè)研究。 Morris等[3]用FQ-PCR對(duì)黑猩猩丙型肝炎動(dòng)物模型和臨床丙型肝炎患者血清中丙肝病毒（HCV）進(jìn)行了研究。測(cè)定顯示，可測(cè)得的樣品濃度相當(dāng)于每毫升13個(gè)基因組。與巢式PCR比較顯示，F(xiàn)Q-PCR有著與巢式PCR相同的敏感性。另外，還對(duì)48例臨床丙型肝炎病人血清樣品進(jìn)行了測(cè)試，32例樣品兩種檢測(cè)方法均為陽性，10例均為陰性；另有6例用兩種方法測(cè)定的結(jié)果不一致。該6例樣品又讓第三個(gè)實(shí)驗(yàn)室用巢式PCR方法重新測(cè)定，其結(jié)果與FQ-PCR測(cè)定的結(jié)果一致率為*。FQ-PCR技術(shù)在保持巢式PCR高度敏感性的同時(shí)又能提率，因此可作為一種檢測(cè)HCV的有效方法。同時(shí)，由于FQ-PCR可以測(cè)出血清中病原體濃度，故可給藥物治療及療效觀察提供參考依據(jù)。 
與及其癌前病變有關(guān)的人類瘤病毒（HPV）有多種類型，以HPV-16、18、31、33、35等類型危險(xiǎn)性zui高。Swan等[4]1997年用FQ-PCR技術(shù)對(duì)子宮灌洗標(biāo)本進(jìn)行了研究。 
他們發(fā)現(xiàn)，由于熒光探針的應(yīng)用，對(duì)各型HPV的檢測(cè)變得十分方便和準(zhǔn)確。由于HPV-16的特異引物可以和HPV-66的模板DNA發(fā)生錯(cuò)配，用一般PCR 方法擴(kuò)增時(shí)，如有HPV-66存在，即可擴(kuò)增出HPV-66片段而發(fā)生誤診，但是HPV-16特異探針的應(yīng)用使HPV-66在TaqMan系統(tǒng)中不能擴(kuò)增。因此，F(xiàn)Q-PCR對(duì)不同亞型的病毒檢測(cè)具有高度特異性。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)FQ-PCR具有高度敏感性，用一般PCR方法檢測(cè)不到的HPV模板濃度在 TaqMan系統(tǒng)中卻可檢測(cè)到。對(duì)于HPV-16、18、31、33、35類型敏感高達(dá)到每100～1000個(gè)細(xì)胞中含有一個(gè)拷貝的HPV基因組，平均每 300個(gè)細(xì)胞中含有一個(gè)拷貝的HPV基因組。 
以前常規(guī)檢測(cè)大腸桿菌的方法，都是采用多種選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)分離法，對(duì)產(chǎn)志賀氏毒素的大腸桿菌（SLTEC）缺乏特異性，因此這種菌株的檢測(cè)又費(fèi)時(shí)又困難。后來又有應(yīng)用抗體的免疫學(xué)方法和核酸序列測(cè)定的生化方法及以DNA擴(kuò)增為基礎(chǔ)的PCR方法等，都因?yàn)榉爆崳枰罅康腜CR后處理過程及不能對(duì)標(biāo)本定量而受到限制。美國Witham等[5]1996年將FQ-PCR技術(shù)應(yīng)用于牛肉中大腸桿菌志賀氏毒素基因的檢測(cè)研究。針對(duì)不同血清變異型的大腸桿菌，他們?cè)O(shè)計(jì)應(yīng)用不同的探針，從而提高了實(shí)驗(yàn)特異性。他們同時(shí)還對(duì)探針相對(duì)于引物的位置、反應(yīng)液中探針濃度、鎂離子濃度等影響實(shí)驗(yàn)的因素進(jìn)行了優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，以提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和性。由于TaqMan系統(tǒng)可以一次測(cè)量96管樣品，還可對(duì)模板進(jìn)行準(zhǔn)確定量，又不需要進(jìn)行電滬及EB染色后處理過程，實(shí)際應(yīng)用方便，從而提高了實(shí)驗(yàn)的參考價(jià)值和應(yīng)用價(jià)值。因此該實(shí)驗(yàn)方法是食品檢測(cè)方面的一個(gè)突破。此外，加拿大Chen等[6]1997年也把FQ-PCR技術(shù)用于食品中沙門氏桿菌的檢測(cè)研究。 
在抗癆治療開始后，結(jié)核病人痰中可持續(xù)存在有結(jié)核桿菌，為了研究結(jié)核病人痰標(biāo)本DNA定量結(jié)果是否與有活力的結(jié)核桿菌數(shù)量相符合并監(jiān)測(cè)治療反應(yīng)，1998年美國Desardin等[7]用FQ-PCR和競(jìng)爭(zhēng)性PCR兩種方法定量檢測(cè)治療期間連續(xù)收集的結(jié)核病人痰標(biāo)本，結(jié)果顯示兩種方法有較好的重復(fù)性和準(zhǔn)確性。痰中結(jié)核桿菌DNA定量結(jié)果與抗酸染色顯微鏡下計(jì)數(shù)的結(jié)果一致。 
 
3.2腫瘤研究 
意大利Gelmini等 [2]用FQ-PCR技術(shù)檢測(cè)癌標(biāo)本c-erbB-2基因拷貝數(shù)目變異情況。他們以β-肌動(dòng)蛋白基因?yàn)閰⒄仗剿鲗?shí)驗(yàn)條件，當(dāng)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)在 28～31之間時(shí)，△RQ與模板DNA有著較好的劑量依賴關(guān)系。他們?cè)诖藯l件下擴(kuò)增了c-erbB-2基因和β-球蛋白基因，發(fā)現(xiàn)△RQ都與各自的模板 DNA濃度存在著線性關(guān)系，雖然二者斜率不同，但是各個(gè)實(shí)驗(yàn)濃度下二者的△RQ之比卻是恒定的。說明盡管二者發(fā)光效率不同，卻不影響定量效果。為了檢驗(yàn) FQ-PCR的準(zhǔn)確性和對(duì)不同基因拷貝數(shù)的分辨率，他們將c-erbB-2基因的DNA樣本用正常胎盤DNA做不同倍數(shù)稀釋后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測(cè)得的結(jié)果與期望值高度相關(guān)（r=0.997）。他們將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與Southern印跡結(jié)果和已報(bào)告的競(jìng)爭(zhēng)性PCR結(jié)果比較都顯示高度相關(guān)性（n=25，r=0.94，P <0.01）。 
1998年法國Bieche等[8]用FQ-PCR測(cè)定了108例癌標(biāo)本。他們選擇擴(kuò)增頻率較高的myc、ccnd1和 erbB2基因進(jìn)行擴(kuò)增，在108例標(biāo)本中，發(fā)現(xiàn)10%的myc基因、23%的ccnd1基因和15%的erbB2基因都有不同程度拷貝數(shù)增加，拷貝數(shù)增加的zui大值分別為4.6、18.6、15.1。同時(shí)他們又將這些數(shù)據(jù)與Southern印跡的結(jié)果進(jìn)行比較，顯示了較好的相關(guān)性。 
 
3.3基因表達(dá)研究 
由于TaqMan系統(tǒng)及熒光探針的應(yīng)用，對(duì)mRNA的檢測(cè)顯得較以前常用的方法如Northern印跡、RT-PCR定量法要方便、快速、準(zhǔn)確得多。為了探測(cè)骨髓基質(zhì)血小板生成因子（TPO）在巨核細(xì)胞生成過程中的作用以及血小板生成因子在特發(fā)性血小板減少性紫瘢（ITP）、再生障礙性貧血（AA）和特發(fā)性血小板多癥（ET）等疾病過程中的病理生理意義，日本Hirayama等[9]用TaqMan EZ RT-PCR試劑盒在ABI7700反應(yīng)系統(tǒng)測(cè)定了正常人和ITP、AA、ET病人的骨髓基質(zhì)細(xì)胞TPO mRNA水平，又用ELISA方法測(cè)定了骨髓和末梢血的TPO濃度。結(jié)果顯示ITP和AA病人TPO mRNA水平明顯升高，而ET病人的TPO mRNA水平則正常，經(jīng)類固醇治療后ITP病人TPO mRNA水平下降；骨髓TPO的濃度與其 mRNA水平有相關(guān)性；在正常人和ITP病人，TPO mRNA表達(dá)水平與巨核細(xì)胞計(jì)數(shù)也有相關(guān)性。這個(gè)實(shí)驗(yàn)對(duì)闡明TPO 的作用提供了依據(jù)。日本Shimokawa等[10]也用FQ-PCR技術(shù)對(duì)鼠成肌細(xì)胞系C2C12中肌肉調(diào)節(jié)因子的表達(dá)水平及動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了研究。 
 
3.4免疫組份分析 
對(duì)免疫T細(xì)胞群體V-β組份進(jìn)行分析是研究健康和疾病免疫應(yīng)答反應(yīng)的重要手段，可通過流式細(xì)胞法或RFQ-PCR法來進(jìn)行[11，12]。流式細(xì)胞法是通過對(duì)細(xì)胞群體進(jìn)行直接而方便的V-β表達(dá)方面的研究，但需要一整套單克隆抗體和大量細(xì)胞來進(jìn)行染色分析，而且人類V-β特異性抗體尚不完備，因此該方法有許多不便之處。如果用FQ-PCR方法，即不需要大量細(xì)胞，引物設(shè)計(jì)也很方便，而且已有多種定量方法，包括錨式PCR法、半定量PCR法、競(jìng)爭(zhēng)性PCR法等[13，14]，但都因PCR產(chǎn)物的后處理過程需凝膠電泳、EB染色和光密度測(cè)量等既費(fèi)時(shí)，又降低了準(zhǔn)確性，還增加了污染機(jī)會(huì)，使得FQ-PCR的應(yīng)用受到限制。1997年Lang等[15]用FQ-PCR技術(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，從而避免了這些問題，他們?cè)诜磻?yīng)系統(tǒng)中引入熒光探針，將下游引物與探針固定，然后，針對(duì)不同的V-β成份，選用特異的上游引物進(jìn)行擴(kuò)增，再對(duì)反應(yīng)中產(chǎn)生的熒光信號(hào)進(jìn)行處理，即可獲得各個(gè)成份的數(shù)據(jù)。 
 
3.5基因突變及多態(tài)性的研究 
美國Ibrahim等[16]1997用FQ-PCR技術(shù)對(duì)正常痘病毒多態(tài)性進(jìn)行了研究。他們采用一對(duì)可與正常痘病毒血凝素基因的某一DNA片段結(jié)合的引物，并設(shè)計(jì)兩個(gè)有單核苷酸差異的寡核苷酸探針，用熒光標(biāo)記后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，順利地把有此單核苷酸差異的兩個(gè)痘病毒株進(jìn)行鑒定。該技術(shù)也可用于猴痘和病毒DNA疫苗的單核苷酸變異多態(tài)的研究。 
 
3.6其他方面 
日本Iso7]利用FQ-PCR進(jìn)行葉綠體成熟度與其基因組拷貝數(shù)關(guān)系的研究。他們以核基因Cab作為內(nèi)參照，進(jìn)行葉綠體基因rbc1拷貝數(shù)測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)子葉出現(xiàn)以后，葉綠體基因拷貝數(shù)顯著增加，進(jìn)而把葉綠體的基因拷貝數(shù)增加與光誘導(dǎo)的葉綠體成熟過程起來。1998年美國Higgins等[18]還建立起一套用熒光探針檢測(cè)鼠疫纖溶酶原激活基因（pla）的實(shí)驗(yàn)方法。 
 
4 結(jié)語 
綜上所述，F(xiàn)Q-PCR作為一種核酸定量技術(shù)，應(yīng)用較多且較成熟的主要是在病原體檢測(cè)方面，其*性在此方面也得以充分體現(xiàn)。因此將該項(xiàng)技術(shù)進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用于臨床，具有很大潛力。但是在遺傳病和腫瘤研究方面，尤其是基因表達(dá)的研究，該技術(shù)目前應(yīng)用的還較少，在此方面加強(qiáng)研究應(yīng)用，將會(huì)有廣闊的前景。