質(zhì)粒DNA的小量制備

實(shí)驗(yàn)試劑

1. 溶液Ｉ
50mmol/L葡萄糖
25mmol/L Tris．Cl(pH8.0)
10mmol/LEDTA(pH8.0)
溶液Ｉ可成批配制，每瓶約100ml，在6.895×10⁴Pa高壓下蒸氣滅菌15分鐘，貯存于4℃。

2. 溶液Ⅱ
0.2mol/L NaOH（臨用前用10mol/L貯存液現(xiàn)用現(xiàn)稀釋)
1%SDS

3. 溶液Ⅲ
5mol/Ｌ乙酸鉀 60ml
冰乙酸 11.5ml
水 28.5ml
所配成的溶液對(duì)鉀是3mol/L，對(duì)乙酸根是5mol/L。

4. STET
0.1mol/L NaCL
10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)
1mmol/L EDTA(pH8.0)
5% Triton X-100

5. *溶液
 10mg/ml，用10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)配制。

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 細(xì)菌的收獲
  1) 將2ml含相應(yīng)抗生素的LB加入到容量為15ml 并通氣良好（不蓋緊)的試管中，然后接入一單菌落，于30℃劇烈振搖下培養(yǎng)過(guò)夜。
    2) 將1.5ml培養(yǎng)物倒入微量離心管中，用微量離心機(jī)于4℃以12000g離心30秒，將剩余的培養(yǎng)物貯存于4℃。
    3) 吸去培養(yǎng)液，使細(xì)菌沉淀盡可能干燥。除去上清的簡(jiǎn)便方法是用一次性使用的吸頭與真空管道相連，輕緩抽吸，并用吸頭接觸液面。當(dāng)液體從管中吸出時(shí)，盡可能使吸頭遠(yuǎn)離細(xì)菌沉淀，然后繼續(xù)用吸頭通過(guò)抽真空除去附于管壁的液滴。
2. 堿裂解法
    1) 將細(xì)菌沉淀，所得重懸于100μl用冰預(yù)冷的溶液Ｉ中，劇烈振蕩。須確使細(xì)菌沉淀在溶液Ｉ中*分散，將兩個(gè)微量離心管的管底部互相接觸震蕩，可使沉淀迅速分散。
    2) 加200μl新配制的溶液Ⅱ。蓋緊管口，快速顛倒離心管５次，以混合內(nèi)容物。應(yīng)確保離心管的整個(gè)內(nèi)表面均與溶液Ⅱ接觸。不要振蕩，將離心管放置于冰上。
    3) 加150μl用冰預(yù)冷的溶液Ⅲ，蓋緊管口，將管倒置后和地振蕩10秒鐘溶液Ⅲ在粘稠的細(xì)菌裂解物中分散均勻，之后將管置于冰上３-５分鐘。
    4) 用微量離心機(jī)于4℃12 000g離心5分種，將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。
    5) 可做可不做：加等量酚：，振蕩混勻，用微量離心機(jī)于4 ℃以12000g離心２分鐘，將上清轉(zhuǎn)移到另一良心管中。有些工作者認(rèn)為不*酚：進(jìn)行抽提，然而由于一些未知的原因，省略這一步，往往會(huì)得到可耐受限制酶切反應(yīng)的DNA。
   6) 用2倍休積的乙醇于室溫沉淀雙鏈DNA。振蕩混合，于室溫放置２分鐘。
   7) 用微量離心機(jī)于4℃以12 000g離心５分鐘。
   8) 小心吸去上清液，將離心管倒置于一張紙巾上，以使所有液體流出。再將附于管壁的液滴除盡。除去上清的簡(jiǎn)便方法是用一次性使用的吸頭與真空管道相連，并用吸頭接觸液面。當(dāng)液體從管中吸出時(shí)，盡量使吸頭遠(yuǎn)離核酸沉淀，然后繼續(xù)用吸頭通過(guò)抽真空除去附于管壁的液滴。
   9) 用1ml70%乙醇于4℃洗滌雙鏈DNA沉淀，按步驟H所術(shù)方法去掉上清，在空氣中使核酸沉淀干燥10分鐘。

注：
1. 此法制備的高拷貝數(shù)質(zhì)粒（如Ｘf3或pUC)，其產(chǎn)量一般約為：每毫升原細(xì)菌培養(yǎng)物3-5μg。
2．如果要通過(guò)限制酶切割反應(yīng)來(lái)分析DNA，可取1μl DNA溶液加到另一含８μl水的微量離心管內(nèi)，加1μl 10×限制酶緩沖液和１單位所需限制酶，在適宜溫育1-2小時(shí)。將剩余的DNA貯存于－20℃。
3. 此方法按適當(dāng)比例放大可適用于100ml細(xì)菌培養(yǎng)物：

3. 煮沸裂解

   1) 將細(xì)菌沉淀，所得重懸于350μlSTET中。

   2) 加25μl新配制的*溶液，振蕩3秒鐘以混勻之。如果溶淮中pH低于8.0，*就不能有效發(fā)揮作用。
   3) 將離心管放入煮沸的水浴中，時(shí)間恰為40秒。
   4) 用微量離心機(jī)于室溫以12 000g離心10分種。
   5) 用無(wú)菌牙簽從微量離心管中去除細(xì)菌碎片。
   6) 在上清中加入40μl 5mol/L乙酸鈉（pH5.2)和420μl異丙醇，振蕩混勻，于室溫放置5分鐘。
   7) 用微量離心機(jī)于4℃以12 000g離心5分種，回收核酸沉淀。
   8) 小心吸去上清液，將離心管倒置于一張紙巾上，以使所有液體流出。再將附于管壁的液滴除盡。除去上清的簡(jiǎn)便方法是用一次性使用的吸頭與真空管道相連，輕緩抽吸，并用吸頭接觸液面。當(dāng)液體從管中吸出時(shí)，盡可能使吸頭遠(yuǎn)離核酸沉淀，然后繼續(xù)用吸頭通過(guò)抽真空除去附于管的液滴。
   9) 加1ml 70％乙醇，于4℃以12 000g離心２分鐘。
  10) 按步驟H所述再次輕輕地吸去上清，這一步操作要格外小心，因?yàn)橛袝r(shí)沉淀塊貼壁不緊，去除管壁上形成的所有乙醇液滴，打開(kāi)管口，放于室溫直至乙醇揮發(fā)殆盡，管內(nèi)無(wú)可見(jiàn)的液體（2-5)分鐘。
  11) 用50μl含無(wú)DNA酶的胰RNA酶（20μg/ml)的TE(pH8.0)溶解核酸稍加振蕩，貯存于-20℃。
注：當(dāng)從表達(dá)內(nèi)切核酸酶Ａ的大腸桿菌株（endA 株，如HB101 )中小量制粒尤其DNA時(shí)，建議舍棄煮沸法。因?yàn)橹蠓胁襟E不能*滅活內(nèi)切核酸酶Ａ，以后在Mg² 存在下溫育（V中用限制酶時(shí))質(zhì)粒DNA可被降解。在上述方案的步驟I之間增加一步，即用酚：進(jìn)行抽提，可以避免這一問(wèn)題。